Pinin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405373-ACT

Das humane PNN kodiert Pinin, ein kern- und desmosomenassoziiertes Protein, das die Zell‑Zell‑Adhäsion epithelialer Zellen mit Transkriptions- sowie RNA‑Verarbeitungsprogrammen verknüpft. Pinin ist an der mRNA‑Spleißung und an Prozessen im Zusammenhang mit dem Exon‑Junction‑Komplex beteiligt und beeinflusst dadurch alternative Spleißentscheidungen sowie Genexpressionsnetzwerke, die die epitheliale Differenzierung und die Gewebeintegrität prägen. Über seine Funktionen in der Desmosomenorganisation, in nukleären Speckles und in der Regulation der Transkript-Reifung kann PNN Signalwege modulieren, die an Zellpolarität, Migration und stressabhängiger Genregulation beteiligt sind. Eine veränderte PNN‑Expression oder -Lokalisation wurde mit Veränderungen des epithelialen Phänotyps in Verbindung gebracht und im Kontext von Tumorprogression, metastaseassoziierten Transkriptionsprogrammen sowie anderen Erkrankungen mit Störungen der Adhäsion und des Spleißens untersucht.

Pinin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PNN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pinin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PNN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PNN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pinin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PNN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pinin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pinin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PNN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.