periplakin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402350-ACT

Das humane PPL kodiert Periplakin, ein Zytolinker aus der Plakin-Familie, der Intermediärfilamente mit Desmosomen und der verhornten Hülle (cornified envelope) verbindet und so die mechanische Stabilität von Epithel- und Endothelgewebe unterstützt. Periplakin ist an der Desmosomenassemblierung, der Organisation des Keratinnetzwerks sowie am zytoskeletalen Umbau während Differenzierung und Wundantworten beteiligt und kann Signalausgänge beeinflussen, die mit Zelladhäsion und Stresswegen verknüpft sind. Eine veränderte PPL-Expression oder -Lokalisation wurde bei mehreren epithelialen Pathologien beschrieben, darunter entzündliche Hauterkrankungen und Krebserkrankungen, bei denen Veränderungen der Integrität von Zell-Zell-Kontakten und des Migrationsverhaltens relevant sind. Als Gerüstprotein an der Zellperipherie wird Periplakin häufig im Kontext von Barrierebildung, epithelialer Polarität und kontaktstellenabhängiger Regulation von Proliferation und Invasion untersucht.

periplakin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

periplakin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen periplakin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von periplakin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des periplakin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.