PCNA Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-400037-ACT-2

Il PCNA umano (proliferating cell nuclear antigen) è una pinza scorrevole del DNA omotrimerica che funge da impalcatura centrale per le DNA polimerasi e per numerosi fattori di riparazione e di modificazione della cromatina, coordinando una sintesi del DNA ad alta processività durante la fase S. Integra la replicazione con le vie di tolleranza al danno del DNA e di riparazione, tra cui la riparazione dei mismatch, la riparazione per escissione di basi, la riparazione per escissione di nucleotidi e la sintesi translesione, e la sua attività è regolata da modificazioni post-traduzionali come l’ubiquitinazione e la SUMOilazione, che influenzano la selezione dei partner. Un’espressione o reti di interazione del PCNA deregolate sono spesso associate all’instabilità genomica e alla proliferazione aberrante osservate nel cancro e in altre patologie legate allo stress replicativo. Il PCNA è ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica come marcatore della progressione del ciclo cellulare e come punto di accesso meccanicistico per indagare l’architettura del replisoma, la dinamica delle forcelle di replicazione e la scelta delle vie di riparazione nelle cellule umane.

PCNA Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCNA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PCNA Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCNA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCNA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PCNA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCNA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PCNA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PCNA nelle cellule tumorali con espressione di PCNA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.