Plásmido CRISPR de Activación (h) Pax-3: sc-401657-ACT

PAX3 codifica el factor de transcripción de la familia paired box Pax-3, un regulador clave del patrón embrionario que coordina la especificación de la cresta neural, la miogénesis y el compromiso de linaje de los melanocitos. Pax-3 controla programas de expresión génica que gobiernan el mantenimiento de progenitores, la migración y la diferenciación, integrándose con redes de señalización del desarrollo que incluyen las vías WNT, BMP y FGF. En la biología humana, la regulación alterada de PAX3 se asocia con fenotipos de pigmentación y de desarrollo craneofacial, y se estudia con frecuencia en contextos de plasticidad de linaje. La actividad desregulada de PAX3 también es relevante para circuitos transcripcionales oncogénicos, incluidos mecanismos impulsados por fusiones y estados aberrantes tipo célula madre en modelos de investigación de sarcoma y melanoma.

Pax-3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PAX3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Pax-3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PAX3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PAX3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Pax-3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PAX3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Pax-3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Pax-3 en células tumorales con expresión de PAX3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.