Pals1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403059-ACT

O MPP5 humano codifica a Pals1 (proteína associada a Lin seven 1), uma proteína de andaime que se localiza nas junções apertadas e na membrana apical para organizar a polaridade epitelial. A Pals1 atua no complexo de polaridade Crumbs e interage com os conjuntos PAR e de junções apertadas para coordenar a maturação das junções, o tráfego vesicular e a formação de barreira. Por meio dessas funções, o MPP5 contribui para a arquitetura tecidual em epitélios e neuroepitélios, e sua desregulação é estudada no contexto de perda de polaridade, migração celular alterada e instabilidade juncional associadas à disfunção epitelial e a remodelamentos relevantes para doenças.

Pals1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MPP5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Pals1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MPP5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MPP5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Pals1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MPP5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Pals1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Pals1 em células tumorais com expressão de MPP5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.