p35 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400431-ACT

O CDK5R1 humano codifica a p35, uma subunidade regulatória enriquecida em neurônios que se liga e ativa a quinase dependente de ciclina 5 (CDK5), moldando a atividade dessa quinase, essencial para o desenvolvimento neuronal e a função sináptica. O complexo CDK5–p35 coordena processos que incluem o crescimento de neuritos, a migração neuronal, a remodelação do citoesqueleto e a sinalização dependente de atividade, por meio da fosforilação de substratos que influenciam a dinâmica dos microtúbulos e o tráfego vesicular. A desregulação da homeostase de CDK5R1/p35, incluindo proteólise alterada e sinalização aberrante de CDK5, tem sido associada a fenótipos neurodegenerativos e do neurodesenvolvimento e é frequentemente estudada em modelos de estresse neuronal e disfunção sináptica. Como um nó de via que conecta a sinalização dependente de cálcio a desfechos citosqueléticos e transcricionais, a p35 oferece uma ferramenta prática para estudos mecanísticos em sistemas neuronais e gliais.

p35 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDK5R1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p35 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDK5R1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDK5R1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p35. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDK5R1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p35 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p35 em células tumorais com expressão de CDK5R1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.