p300 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400055-ACT

Das humane EP300 kodiert p300, eine Lysin-Acetyltransferase und transkriptionellen Koaktivator, der Signale zahlreicher Transkriptionsfaktoren integriert, um die Chromatinzugänglichkeit und Genexpression zu regulieren. p300 acetyliert Histone und nicht-histonische Proteine, formt dadurch die Enhancer-Aktivität und steuert Programme, die an Zellzyklusprogression, Differenzierung, DNA-Schadensantworten und Stresssignalgebung beteiligt sind. EP300 ist über umfangreiche Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke an Signalwegen beteiligt, die mit MAPK/ERK, TGF-β/SMAD, Hypoxie (HIF) sowie p53-vermittelter transkriptioneller Regulation verknüpft sind. Eine Fehlregulation der EP300/p300-abhängigen Acetylierung und Transkriptionskontrolle wird mit veränderter Linienfestlegung und aberranten Transkriptionszuständen in Zusammenhang gebracht, wie sie in vielfältigen Krankheitsmodellen beobachtet werden.

p300 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EP300-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p300 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EP300-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EP300-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p300-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EP300-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p300-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p300-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EP300-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.