p120 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400943-ACT

CTNND1 codifica la p120-catenina (p120), una proteina a ripetizioni armadillo che si lega alla regione juxtamembrana delle caderine classiche e stabilizza le giunzioni aderenti limitando l’endocitosi e il turnover delle caderine. Coordinando i complessi caderina–catenina con la segnalazione delle GTPasi della famiglia Rho, p120 influenza la dinamica del citoscheletro di actina, la polarità epiteliale e il controllo della crescita dipendente dal contatto, intersecandosi con vie che regolano la migrazione cellulare e la morfogenesi tissutale. Alterazioni dell’espressione di CTNND1 o della localizzazione di p120 sono state associate, in modelli di cancro, a programmi di adesione cellula–cellula compromessi e a fenotipi invasivi; inoltre, la perturbazione di CTNND1 è studiata anche nel contesto di disturbi dello sviluppo che interessano la biologia craniofacciale ed epiteliale.

p120 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CTNND1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p120 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CTNND1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CTNND1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p120. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CTNND1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p120 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p120 nelle cellule tumorali con espressione di CTNND1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.