Plásmido CRISPR de Activación (h) NMDAε4: sc-401683-ACT

GRIN2D codifica la subunidad del receptor NMDA humano NMDAε4 (GluN2D), un componente modulador de los receptores ionotrópicos de glutamato que regula la transmisión sináptica permeable a Ca²⁺ y la integración de señales dependiente de la actividad. La incorporación de NMDAε4 influye en la cinética del canal, la sensibilidad a los agonistas y los patrones del desarrollo de la neurotransmisión excitatoria, modelando la plasticidad sináptica y la excitabilidad de las redes neuronales. La señalización del receptor NMDA activa vías dependientes de calcio, incluidas CaMK/CREB, MAPK/ERK y programas dependientes de calcineurina, que regulan la expresión génica y la maduración de las sinapsis. La desregulación de la señalización glutamatérgica asociada a GRIN2D se ha vinculado con fenotipos del neurodesarrollo y neurológicos, lo que lo convierte en un locus útil para estudios mecanísticos del estrés excitotóxico, la función de los circuitos y las relaciones genotipo–fenotipo.

NMDAε4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GRIN2D sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NMDAε4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GRIN2D en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GRIN2D, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NMDAε4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GRIN2D y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NMDAε4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NMDAε4 en células tumorales con expresión de GRIN2D silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.