nm23-H7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403079-ACT

NME7 umano codifica nm23-H7, un membro della famiglia delle chinasi dei nucleosidi difosfato (NDPK/NME) implicata nella regolazione dell’omeostasi dei nucleotidi e degli output di segnalazione che dipendono da pool di NTP bilanciati. nm23-H7 è stata collegata a processi associati al centrosoma e ai microtubuli, supportando la progressione del ciclo cellulare, il trasporto intracellulare e l’organizzazione dell’architettura del citoscheletro. Alterazioni dell’attività della famiglia NME sono state osservate in molteplici contesti patologici, rendendo NME7 un nodo utile per studiare come le perturbazioni del metabolismo dei nucleotidi si intersechino con la segnalazione proliferativa e il mantenimento del genoma. Di conseguenza, NME7 viene spesso analizzato in modelli di crescita cellulare aberrante, instabilità cromosomica e programmi trascrizionali di adattamento allo stress.

nm23-H7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NME7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

nm23-H7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NME7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NME7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di nm23-H7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NME7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da nm23-H7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via nm23-H7 nelle cellule tumorali con espressione di NME7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.