NEDD4-L CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403647-ACT

NEDD4L kodiert NEDD4-L, eine E3-Ubiquitin-Ligase vom HECT-Typ, die den Proteinumsatz reguliert, indem sie die Übertragung von Ubiquitin auf spezifische membranständige und zytosolische Substrate katalysiert. Am bekanntesten ist NEDD4-L für die Kontrolle der Oberflächenverfügbarkeit und des Traffickings des epithelialen Natriumkanals (ENaC), wodurch die Aktivität von NEDD4-L mit Ionentransport, Flüssigkeitshomöostase und zellulären Stressantworten verknüpft ist. NEDD4-L greift zudem in Signalwege wie TGF-β/SMAD und Wnt/β-Catenin ein, indem es über ubiquitinabhängige Modulation von Signalwegkomponenten deren Aktivität beeinflusst und so Zelldifferenzierung und Gewebeumbau mitsteuert. Eine veränderte Expression oder Funktion von NEDD4L wurde mit einer Fehlregulation des Natriumhaushalts sowie mit aberranten Signalprogrammen in Verbindung gebracht, die an der Pathobiologie kardiometabolischer und fibrotischer Erkrankungen beteiligt sind.

NEDD4-L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEDD4L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NEDD4-L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEDD4L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEDD4L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NEDD4-L-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEDD4L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NEDD4-L-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NEDD4-L-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEDD4L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.