myoglobin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421575-ACT

Das Mausgen **Mb** kodiert Myoglobin, ein Häm-haltiges, sauerstoffbindendes Protein, das in quergestreifter Muskulatur als Puffer wirkt und die intrazelluläre O₂-Diffusion erleichtert; dadurch unterstützt es die oxidative Phosphorylierung bei schwankender Belastung. Durch die Modulation der lokalen Sauerstoffverfügbarkeit sowie der Stickstoffmonoxid-/Redoxchemie beeinflusst Myoglobin die mitochondriale Atmung, den Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies und die metabolische Anpassung an Hypoxie und körperliche Belastung. Veränderungen in Menge oder Funktion von Myoglobin wurden in Zusammenhängen wie Muskelverletzungen, Myopathien und ischämieassoziiertem Stress untersucht, bei denen Sauerstofftransport und mitochondriale Leistungsfähigkeit limitierende Faktoren sind. In der biomedizinischen Forschung dient **Mb** als gut zugänglicher Knotenpunkt, um Muskelenergetik, Sauerstoffsensorik-Programme und Signalwege des oxidativen Stresses in vivo sowie in kultivierten Myozyten zu untersuchen.

myoglobin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mb-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

myoglobin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mb-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mb-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen myoglobin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mb-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von myoglobin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des myoglobin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mb-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.