Myf-5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400449-ACT

MYF5 kodiert den myogenen Regulationsfaktor Myf-5, einen basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor, der als früher Determinant der Festlegung auf die Skelettmuskel-Linie dient. Myf-5 koordiniert die Spezifizierung und Differenzierung von Myoblasten, indem es myogene Gennetzwerke reguliert und mit anderen Mitgliedern der MRF-Familie zusammenwirkt, um den Austritt aus dem Zellzyklus und die Expression muskelstruktureller Gene zu steuern. Seine Aktivität ist in entwicklungsbiologische Signale eingebettet, darunter Signalwege wie Wnt und Notch, die Schicksalsentscheidungen von Vorläuferzellen und die Musterbildung der Muskulatur prägen. Eine fehlregulierte MYF5-Expression oder gestörte regulatorische Schaltkreise wurden mit veränderter Myogenese in Verbindung gebracht und werden häufig in Kontexten wie Sarkomen und anderen Tumoren mit myogenen Programmen untersucht.

Myf-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MYF5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Myf-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MYF5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MYF5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Myf-5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MYF5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Myf-5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Myf-5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MYF5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.