Munc13-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404319-ACT

UNC13D codifica a Munc13-4, um fator de “priming” essencial para a exocitose regulada por Ca²⁺ de grânulos citotóxicos e de outros lisossomos secretórios em células imunes. A Munc13-4 coordena o ancoramento e a fusão de vesículas ao regular a montagem do complexo SNARE, sustentando vias que controlam a degranulação, o tráfego de membranas e a secreção regulada. Alterações na função de UNC13D comprometem a atividade citolítica de células NK e de linfócitos T citotóxicos e estão associadas a síndromes de desregulação imune caracterizadas por liberação deficiente de grânulos. Por isso, UNC13D é frequentemente estudado no contexto da função efetora de linfócitos, de pontos de controle do transporte vesicular e da sinalização inflamatória ligada a defeitos de secreção.

Munc13-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UNC13D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Munc13-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UNC13D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UNC13D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Munc13-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UNC13D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Munc13-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Munc13-4 em células tumorais com expressão de UNC13D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.