MLL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401307-ACT

KMT2A (MLL) codifica una metiltransferasi della lisina istonica con dominio SET che catalizza la metilazione di H3K4, regolando l’accessibilità della cromatina e i programmi trascrizionali che controllano lo sviluppo ematopoietico e la specificazione del destino cellulare. MLL agisce in grandi complessi nucleari che coordinano la “scrittura” epigenetica con l’allungamento trascrizionale a livello di promotori ed enhancer, influenzando vie come la regolazione dei geni HOX, le risposte al danno al DNA e la differenziazione. La disregolazione di KMT2A, dovuta ad alterata espressione o a riarrangiamenti genomici, è fortemente associata a stati trascrizionali aberranti nella leucemia e in altre neoplasie, rendendo MLL un nodo centrale per lo studio del controllo epigenetico dell’espressione genica oncogenica. Il suo ampio ruolo nella regolazione mediata dalla cromatina supporta inoltre l’analisi di effetti dipendenti dal contesto su proliferazione, impegno di linea e stabilità delle reti trascrizionali nelle cellule umane.

MLL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KMT2A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MLL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KMT2A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KMT2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MLL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KMT2A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MLL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MLL nelle cellule tumorali con espressione di KMT2A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.