MECL-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402101-ACT

PSMB10 kodiert MECL-1, eine induzierbare β‑Untereinheit des Immunproteasoms, die als Reaktion auf entzündliche Signale wie Interferon‑γ konstitutive Proteasomkomponenten ersetzt. MECL-1 trägt zum ubiquitinabhängigen Proteinabbau bei und beeinflusst die MHC‑Klasse‑I‑Antigenprozessierung, indem es die Entstehung von Peptid-Epitopen mitbestimmt, die CD8+-T‑Zellen präsentiert werden. Über seine Rolle in der Proteostase und der Immunüberwachung kann eine veränderte Zusammensetzung des Immunproteasoms inflammatorische Signalwege, die Dynamik der Antigenpräsentation und zelluläre Stressantworten beeinflussen. Eine Fehlregulation von Immunproteasom‑Untereinheiten, einschließlich MECL-1, wird in translationalen Forschungskontexten mit immunvermittelter Pathologie sowie Mechanismen der Tumor‑assoziierten Immunflucht in Verbindung gebracht.

MECL-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PSMB10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MECL-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PSMB10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PSMB10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MECL-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PSMB10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MECL-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MECL-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PSMB10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.