LRF/Pokemon Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402016-ACT

ZBTB7A codifica il fattore di trascrizione LRF/Pokemon, una proteina a dita di zinco BTB/POZ che regola programmi di espressione genica responsabili del destino cellulare, della proliferazione e della differenziazione. LRF/Pokemon partecipa alla repressione e all’attivazione trascrizionale associate alla cromatina, influenzando le scelte di linea in contesti ematopoietici e in altri processi di sviluppo, e interagendo con vie che governano il controllo del ciclo cellulare e le risposte allo stress. Un’attività dis-regolata di ZBTB7A è stata collegata a reti trascrizionali alterate nella biologia del cancro e a perturbazioni nello sviluppo eritroide e delle cellule immunitarie, rendendolo un nodo utile per studiare i circuiti di fattori di trascrizione oncogenici. Investigare la funzione di ZBTB7A supporta studi meccanicistici sulla regolazione di promotori/enhancer, sulle transizioni dello stato epigenetico e sul rimodellamento trascrizionale dipendente dal contesto.

LRF/Pokemon Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZBTB7A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LRF/Pokemon Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZBTB7A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZBTB7A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LRF/Pokemon. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZBTB7A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LRF/Pokemon nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LRF/Pokemon nelle cellule tumorali con espressione di ZBTB7A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.