KIF3A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403463-ACT

KIF3A codifica uma subunidade motora da cinesina-2 que promove o transporte anterógrado dependente de ATP ao longo de microtúbulos e é essencial para o transporte intraflagelar e para a montagem do cílio primário. Por meio do seu papel no tráfego ciliar, KIF3A sustenta as respostas de sinalização Hedgehog e Wnt que dependem de uma estrutura ciliar adequada e da entrega correta de cargas. A atividade de KIF3A contribui para a polaridade epitelial, o desenvolvimento neuronal e a sinalização celular coordenada no eixo centrossomo–cílio. A desregulação do transporte e da sinalização ciliares associada a KIF3A tem sido implicada em fenótipos relacionados a ciliopatias e em mecanismos que influenciam a biologia das vias aéreas e o comportamento de células tumorais.

KIF3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KIF3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KIF3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KIF3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KIF3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KIF3A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KIF3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KIF3A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KIF3A em células tumorais com expressão de KIF3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.