KIBRA Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402677-LAC

WWC1 codifica KIBRA, una proteina di impalcatura (scaffolding) arricchita in cervello e rene, che integra la segnalazione della via Hippo con l’organizzazione del citoscheletro, la polarità cellulare e il traffico di membrana. KIBRA interagisce con i componenti centrali della via Hippo e con i regolatori della polarità per modulare programmi trascrizionali dipendenti da YAP/TAZ che influenzano proliferazione, differenziamento e omeostasi tissutale. Contribuisce inoltre alla funzione sinaptica e alla segnalazione legata alla memoria coordinando il traffico dei recettori e la dinamica dell’actina. Un’alterata regolazione di WWC1/KIBRA è stata associata a fenotipi neurocognitivi e a un controllo della crescita deregolato in contesti cellulari rilevanti per la malattia, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici mirati alle vie di segnalazione.

Le particelle di attivazione lentivirale KIBRA (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di WWC1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale KIBRA (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione WWC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di KIBRA. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo WWC1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.