karyopherin β3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402071-ACT

IPO5 kodiert den nukleären Importrezeptor Karyopherin β3, ein RanGTP‑abhängiges Mitglied der Transportin‑Familie, das die selektive Translokation von Protein-Cargos durch den Kernporenkomplex vermittelt. Durch die Kontrolle des nukleozytoplasmatischen Transports beeinflusst IPO5 Transkriptionsprogramme, den Zellzyklusverlauf und stressresponsive Signalwege, indem es die nukleare Verfügbarkeit zentraler regulatorischer Proteine steuert. Veränderte Dynamiken des nukleären Transports werden häufig mit onkogener Transformation, der Biologie viraler Infektionen und Neurodegeneration in Verbindung gebracht, wodurch IPO5 ein relevanter Ansatzpunkt ist, um zu untersuchen, wie die Lokalisation von Cargos zelluläre Phänotypen verändert. In humanen Zellen kann ein IPO5‑abhängiger Import die Aktivität von Signalwegen modulieren, indem er die Verweildauer von Transkriptionsfaktoren und anderen Signalproteinen im Zellkern verändert.

karyopherin β3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IPO5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

karyopherin β3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IPO5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IPO5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen karyopherin β3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IPO5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von karyopherin β3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des karyopherin β3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IPO5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.