Plásmido CRISPR de Activación (h2) ITM1: sc-405155-ACT-2

El gen humano STT3A codifica la subunidad catalítica del complejo oligosacariltransferasa (OST), que media la glicosilación N ligada cotraduccional de polipéptidos nacientes en el retículo endoplásmico, moldeando la proteostasis, la maduración de proteínas de membrana y secretadas, y el control de calidad del RE. A través de su papel en la biogénesis de glicoproteínas, STT3A influye en vías como la degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD), la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) y el tráfico de receptores y transportadores que dependen de la correcta incorporación de N glicanos. La desregulación de la glicosilación dependiente de STT3A se ha relacionado con trastornos congénitos de la glicosilación y con fenotipos de adaptación al estrés observados en enfermedades proliferativas, donde el procesamiento alterado de glicanos puede afectar la señalización y las interacciones célula–célula. La edición génica o la perturbación de STT3A en modelos celulares humanos resulta útil para desentrañar la función del complejo OST, cartografiar sitios de glicosilación y dependencias de proteínas cliente, e investigar cómo el estrés del RE y la maduración de glicoproteínas impactan las redes de señalización celular.

ITM1 El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de STT3A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ITM1 El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus STT3A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional STT3A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ITM1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo STT3A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ITM1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ITM1 en células tumorales con expresión de STT3A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.