IRS-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402033-ACT

Das humane Gen *IRS4* kodiert das Insulinrezeptor-Substrat 4 (IRS‑4), einen zytoplasmatischen Adapter, der nachgeschaltet von Insulin- und IGF‑1‑Rezeptoren an Tyrosinresten phosphoryliert wird, um die Rezeptoraktivierung an die Signalwege PI3K–AKT–mTOR und RAS–MAPK zu koppeln. Indem IRS‑4 als Andockplattform für SH2-Domänen-Proteine wie regulatorische PI3K‑Untereinheiten und GRB2‑assoziierte Faktoren dient, beeinflusst es Programme des Glukose- und Lipidstoffwechsels sowie Entscheidungen über Zellwachstum und -überleben. Die Expression von *IRS4* und ein Rewiring der Signalübertragung wurden in krebsbezogenen Kontexten mit veränderter Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren und proliferativen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch es sich als nützlicher Knotenpunkt zur Untersuchung von Crosstalk zwischen Signalwegen und der Feedback‑Regulation in Netzwerken von Rezeptor-Tyrosinkinasen eignet.

IRS-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IRS4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRS-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IRS4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IRS4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRS-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IRS4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRS-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRS-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IRS4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.