ICK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406371-ACT

Die intestinale Zellkinase (ICK) ist eine Serin/Threonin-Proteinkinase, die in primären Zilien und im Zellkern lokalisiert ist und dort die Zellzyklusprogression, die Ziliogenese sowie mikrotubuliabhängige Prozesse reguliert. In menschlichen Zellen trägt ICK zu Signalnetzwerken bei, die mit der Zilienfunktion und der Entwicklungsmusterbildung verknüpft sind, darunter Signalwege, die Überschneidungen mit der Hedgehog-Signaltransduktion und der Zentrosomendynamik aufweisen. Eine Störung der ICK-Aktivität oder -Expression ist mit ciliopathieassoziierten Phänotypen und Entwicklungsstörungen verbunden, was mit ihrer Rolle bei der Koordination von Proliferation und zilienvermittelter Signalgebung übereinstimmt. ICK wird außerdem in Zusammenhängen untersucht, in denen veränderte Kinase-Signalgebung und die Kontrolle der Zilien Differenzierungszustände und die zelluläre Fitness beeinflussen.

ICK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ICK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ICK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ICK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ICK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ICK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ICK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ICK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ICK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ICK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.