Hhip CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403293-ACT

Das humane HHIP-Gen kodiert das Hedgehog-interagierende Protein (Hhip), ein membranassoziiertes Glykoprotein, das Hedgehog-Liganden bindet und die Signalübertragung des Signalwegs abschwächt, indem es die Verfügbarkeit der Liganden für PTCH1/SMO begrenzt. Als negativer Regulator der Hedgehog-Aktivität trägt HHIP zur Feinabstimmung entwicklungsbiologischer Musterbildungsprogramme und der Gewebehomöostase im adulten Organismus bei und beeinflusst dabei Prozesse wie epitheliale Differenzierung, stromal-epitheliale Signalübertragung und Zellproliferation. Eine dysregulierte HHIP-Expression oder ein verändertes Gleichgewicht im Hedgehog-Signalweg wurde mit krankheitsrelevanten Phänotypen in der Onkologie und der chronischen Lungenbiologie in Verbindung gebracht, darunter Effekte auf das Atemwegs-Remodeling und tumorassoziierte Signalnetzwerke. Als Modulator des Signalwegs wird HHIP häufig in Kontexten untersucht, in denen Hedgehog-gesteuerte Transkriptionsprogramme mit WNT-, TGF-β- und inflammatorischer Signalgebung zusammenwirken.

Hhip Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HHIP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Hhip Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HHIP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HHIP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Hhip-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HHIP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Hhip-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Hhip-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HHIP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.