GS28 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404357-ACT

O GOSR1 humano codifica o componente GS28 do complexo receptor SNAP do Golgi, uma SNARE de tráfego vesicular que sustenta o transporte retrógrado dependente de COPI e a fusão de membranas intra-Golgi. Ao coordenar a dinâmica RE–Golgi e das pilhas do Golgi, a GS28 ajuda a manter a arquitetura do Golgi, a capacidade de glicosilação e a triagem correta de cargas ao longo da via secretora. A perturbação do transporte mediado por SNAREs está associada a respostas de estresse celular, alterações da proteostase e programas de tráfego desregulados, frequentemente estudados em neurodegeneração, biologia de infecções e fenótipos secretores de células cancerígenas. Como componente central da maquinaria de fusão de membranas, a GS28 oferece um ponto de intervenção acessível para dissecar como o transporte no Golgi influencia a sinalização, a homeostase de organelos e o processamento proteico.

GS28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GOSR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GS28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GOSR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GOSR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GS28. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GOSR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GS28 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GS28 em células tumorais com expressão de GOSR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.