GPT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402909-ACT

Das humane GPT-Gen kodiert Alanin-Aminotransferase 2, ein mitochondriales Enzym, das die reversible Transaminierung zwischen Alanin und α-Ketoglutarat katalysiert und dabei Pyruvat und Glutamat bildet. Über diese Reaktion trägt GPT dazu bei, die Nutzung von Aminosäuren mit dem TCA-Zyklus, anaplerotischen Prozessen und dem Stickstoffhaushalt zu koppeln und so die mitochondriale Bioenergetik sowie das Redoxgleichgewicht zu unterstützen. Die GPT-Aktivität ist mit übergeordneten Stoffwechselprogrammen verknüpft, die den gluconeogenen Fluss, den Lipidstoffwechsel und zelluläre Antworten auf die Nährstoffverfügbarkeit beeinflussen. Eine Fehlregulation transaminase-assoziierter Stoffwechselwege wird häufig bei metabolischem Stress und bei der krebsassoziierten Umprogrammierung des mitochondrialen Kohlenstoff- und Stickstoffflusses beobachtet, wodurch GPT ein nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung kontextabhängiger metabolischer Verwundbarkeiten ist.

GPT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.