GPRC5D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403114-ACT

GPRC5D (recettore accoppiato a proteina G, classe C, gruppo 5, membro D) codifica una proteina di membrana simile a un GPCR orfano, arricchita in contesti epiteliali e associata a segnali legati alla differenziazione. In quanto membro di una famiglia responsiva all’acido retinoico, GPRC5D viene studiato per le sue connessioni con programmi trascrizionali che influenzano lo stato cellulare, la segnalazione dei recettori di membrana e le interazioni con il microambiente. Un’espressione alterata di GPRC5D è stata riportata nella ricerca sulle neoplasie ematologiche, in particolare nella biologia delle plasmacellule, ed è inoltre analizzata in dataset di tumori solidi e di immuno-oncologia. Queste caratteristiche rendono GPRC5D un bersaglio utile per indagare reti regolatorie collegate ai recettori e fenotipi associati alla linea cellulare nelle cellule umane.

GPRC5D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPRC5D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPRC5D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPRC5D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPRC5D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPRC5D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPRC5D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPRC5D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPRC5D nelle cellule tumorali con espressione di GPRC5D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.