GlcNAc kinase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407809-ACT

NAGK kodiert die humane GlcNAc-Kinase, ein zytosolisches Enzym, das N-Acetylglucosamin zu GlcNAc-6-phosphat phosphoryliert und damit den GlcNAc-Salvage-Weg mit dem Hexosamin-Stoffwechsel verknüpft. Diese Aktivität trägt zur Bildung von UDP-GlcNAc bei, einem zentralen Donorsubstrat für N- und O-gebundene Glykosylierung sowie andere glykanabhängige Prozesse, die Proteinfaltung, intrazellulären Transport und Signaltransduktion regulieren. Durch die Beeinflussung der Glykosylierungskapazität kann NAGK zelluläre Reaktionen auf Nährstoffverfügbarkeit und Stress modulieren, mit nachgeschalteten Effekten auf Zellwachstum und Differenzierungsprogramme. Fehlregulierter Hexosamin-Fluss und veränderte Glykosylierung sind wiederkehrende Merkmale in metabolischen und proliferativen Krankheitskontexten, wodurch NAGK ein nützlicher Knotenpunkt für die mechanistische Untersuchung von Signalwegen ist.

GlcNAc kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NAGK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GlcNAc kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NAGK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NAGK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GlcNAc kinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NAGK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GlcNAc kinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GlcNAc kinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NAGK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.