GFRP CRISPR Activationプラスミド (h): sc-405353-ACT

ヒトGCHFRは、GTPシクロヒドロラーゼI（GCH1）の主要なアロステリック調節因子であるGTPシクロヒドロラーゼIフィードバック調節タンパク質（GFRP）をコードし、de novoテトラヒドロビオプテリン（BH4）生合成を微調整します。GFRPはBH4とフェニルアラニンからのシグナルを統合することで、芳香族アミノ酸水酸化反応および一酸化窒素合成酵素（NOS）活性を支える補因子の恒常性維持に寄与し、神経伝達物質産生やレドックス感受性シグナル伝達に影響を与えます。この調節により、GCHFRはNO依存性の血管・免疫プロセスの代謝制御や、神経系におけるモノアミン生合成経路と結び付けられます。BH4の利用可能性の破綻やGCH1–GFRP制御の変化は、疼痛シグナル、内皮機能障害、神経伝達物質バランスの乱れに関連する表現型と関連づけられており、GCHFRは経路に焦点を当てた研究に有用なノードとなります。

GFRP CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GCHFRの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GFRP CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GCHFR 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGCHFR転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GFRPの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGCHFR遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGFRP依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGCHFR発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGFRP経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。