Plásmido CRISPR de Activación (m2) GAD-65: sc-420471-ACT-2

El gen Gad2 del ratón codifica la descarboxilasa del glutamato 65 (GAD-65), una enzima asociada a membrana que convierte el L-glutamato en el neurotransmisor inhibidor GABA, contribuyendo así a la inhibición sináptica y a la estabilidad de los circuitos neuronales. La GAD-65 está enriquecida en interneuronas GABAérgicas y regula la síntesis de GABA dependiente de la actividad y el suministro vesicular de neurotransmisores en las terminales presinápticas, conectando el flujo metabólico con la neurotransmisión y la plasticidad. La alteración de la función de Gad2/GAD-65 se utiliza ampliamente como punto de entrada molecular para estudiar el equilibrio entre excitación e inhibición y su relevancia para la epilepsia, los fenotipos relacionados con la ansiedad y el estrés, y los trastornos del neurodesarrollo. La edición genética o los modelos de ratón diseñados dirigidos a Gad2 permiten el análisis específico por tipo celular de las redes inhibitorias, la identidad neuronal y el trazado de linajes, y la disección mecanística de las vías de señalización GABAérgicas en el cerebro.

GAD-65 El plásmido de activación CRISPR (m2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Gad2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GAD-65 El plásmido de activación CRISPR (m2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Gad2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Gad2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GAD-65. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Gad2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GAD-65 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GAD-65 en células tumorales con expresión de Gad2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.