frizzled-7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401590-ACT

FZD7 codifica frizzled-7, un recettore transmembrana a sette passaggi che lega i ligandi WNT per avviare la segnalazione canonica della β-catenina e le vie non canoniche della polarità planare cellulare e WNT/Ca²⁺. Attraverso una trasduzione del segnale dipendente da Dishevelled, FZD7 influenza le decisioni sul destino cellulare, la polarità, la migrazione e i fenotipi di tipo staminale, integrando segnali durante lo sviluppo e l’omeostasi tissutale. La disregolazione della segnalazione FZD7/WNT è frequentemente associata a programmi trascrizionali oncogenici, alla transizione epitelio–mesenchimale e a stati di differenziamento alterati in diverse neoplasie. Poiché agisce a livello recettoriale nell’attivazione della via WNT, FZD7 è ampiamente studiato per il suo contributo a output di segnalazione dipendenti dal contesto e al cross-talk tra vie.

frizzled-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FZD7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

frizzled-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FZD7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FZD7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di frizzled-7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FZD7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da frizzled-7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via frizzled-7 nelle cellule tumorali con espressione di FZD7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.