Plasmide CRISPR d'Activation (h) FKHR/FOXO1: sc-400137-ACT

FOXO1 (FKHR) code un facteur de transcription de la famille forkhead box qui intègre les signaux de l’insuline/IGF-1 et des facteurs de croissance afin de coordonner le contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose, les réponses au stress oxydatif et l’homéostasie métabolique. L’activité de FOXO1 est régulée par des modifications post-traductionnelles et par sa localisation sous-cellulaire en aval de la signalisation PI3K–AKT, avec des apports supplémentaires d’AMPK et de voies activées par le stress. Dans le noyau, FOXO1 régule des programmes transcriptionnels impliqués dans la gluconéogenèse, l’autophagie et la différenciation, orientant des décisions de destinée cellulaire dépendantes du contexte. Une dérégulation de la signalisation de FOXO1 est impliquée dans la résistance à l’insuline et les maladies métaboliques, des altérations de la fonction des cellules immunitaires, ainsi que des processus oncogéniques, dont la fusion PAX3–FOXO1 observée dans le rhabdomyosarcome alvéolaire.

FKHR/FOXO1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FOXO1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FKHR/FOXO1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FOXO1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FOXO1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FKHR/FOXO1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FOXO1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FKHR/FOXO1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FKHR/FOXO1 dans les cellules tumorales présentant une expression de FOXO1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.