Fibulin-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404037-ACT

EFEMP2 codifica la fibulina-4, una glicoproteina secreta della matrice extracellulare che si integra nelle microfibrille delle fibre elastiche e sostiene l’elastogenesi attraverso interazioni con la tropoelastina, le fibrilline e il macchinario di reticolazione dipendente dalla lisil ossidasi. La fibulina-4 contribuisce all’organizzazione della matrice extracellulare, alla meccanotrasduzione e all’integrità della parete vascolare, influenzando il rimodellamento del tessuto connettivo e l’omeostasi delle cellule muscolari lisce. Alterazioni dell’espressione di EFEMP2 o disfunzioni della fibulina-4 sono associate a un’assemblaggio compromesso delle fibre elastiche e a difetti della matrice extracellulare collegati a fenotipi ereditari del tessuto connettivo e vascolari. Questi ruoli, incentrati sulla biologia e sulla matrice, rendono EFEMP2 un nodo utile per studiare le vie delle fibre elastiche, la proteostasi della MEC e la segnalazione cellula–matrice in sistemi modello umani.

Fibulin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFEMP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Fibulin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFEMP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFEMP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Fibulin-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFEMP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Fibulin-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Fibulin-4 nelle cellule tumorali con espressione di EFEMP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.