Plasmide CRISPR d'Activation (h) FHOD1: sc-404286-ACT

FHOD1 (formin homology 2 domain containing 1) code une formine apparentée à Diaphanous qui catalyse l’assemblage linéaire des filaments d’actine et coordonne le dialogue croisé actine–microtubules afin de contrôler la forme cellulaire, l’adhérence et la migration directionnelle. L’activité de FHOD1 influence les voies de remodelage du cytosquelette liées aux GTPases Rho et contribue à la formation de fibres de stress ainsi que de structures contractiles actomyosine. Par son rôle dans la dynamique du cytosquelette, FHOD1 a été associée à des processus pertinents pour le remodelage tissulaire, le comportement cellulaire invasif et la motilité dérégulée observée dans de multiples contextes pathologiques, notamment en biologie du cancer. La modulation de l’expression de FHOD1 est donc utile pour disséquer les mécanismes de mécanotransduction, de polarisation cellulaire et de phénotypes dépendants de la migration dans des systèmes modèles humains.

FHOD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FHOD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FHOD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FHOD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FHOD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FHOD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FHOD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FHOD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FHOD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de FHOD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.