Eps8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403249-ACT

EPS8 (Eps8) codifica un substrato della via di EGFR che integra la segnalazione dei recettori tirosin-chinasici con il rimodellamento del citoscheletro di actina. Eps8 agisce in complessi con proteine adattatrici come ABI1 e SOS1 per regolare l’attivazione di Rac, il ruffling di membrana e il controllo dinamico di filopodi e lamellipodi, collegando i segnali dei fattori di crescita alla forma e alla motilità cellulare. Attraverso questi ruoli influenza processi quali endocitosi, adesione e propagazione del segnale a valle delle reti EGFR/ERBB. Un’alterata espressione di EPS8 o un’alterazione dell’accoppiamento con la via di segnalazione è stata associata a migrazione deregolata e a segnalazione proliferativa in diversi contesti cellulari rilevanti per la malattia, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici della segnalazione del citoscheletro.

Eps8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPS8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Eps8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPS8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPS8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Eps8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPS8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Eps8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Eps8 nelle cellule tumorali con espressione di EPS8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.