ephrin-A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401309-ACT

EFNA1 codifica per ephrin-A1, un ligando di superficie cellulare ancorato tramite GPI per le tirosin-chinasi recettoriali EphA, che media una segnalazione dipendente dal contatto per regolare il posizionamento cellulare, la formazione di confini e la patterning tissutale. Le interazioni ephrin-A1/EphA coordinano una segnalazione bidirezionale che influenza le GTPasi della famiglia Rho, la dinamica del citoscheletro, il turnover dell’adesione e la migrazione, con effetti a valle sull’attività delle vie MAPK e PI3K/AKT a seconda del contesto cellulare. Nelle cellule umane, EFNA1 è implicato nel rimodellamento angiogenico, nell’organizzazione epiteliale e nel crosstalk con il microambiente infiammatorio. Una segnalazione di ephrin-A1 deregolata è stata associata ad alterazioni del comportamento vascolare e a fenotipi invasivi nella biologia del cancro, rendendola un nodo utile per lo studio delle reti di segnalazione recettore–ligando e della motilità cellulare dipendente dal microambiente.

ephrin-A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFNA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ephrin-A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFNA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFNA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ephrin-A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFNA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ephrin-A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ephrin-A1 nelle cellule tumorali con espressione di EFNA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.