Emt Plasmide Double Nickase (h): sc-402628-NIC

L’ITK umano (IL2-inducible T-cell kinase) codifica una tirosin-chinasi non recettoriale della famiglia Tec che trasmette i segnali a valle del recettore delle cellule T, dei recettori co-stimolatori e degli input chemiocinici, modulando l’attivazione delle cellule T, la loro differenziazione e la produzione di citochine. ITK integra eventi di fosforilazione prossimali con l’attivazione di PLCγ1, i flussi di calcio, la segnalazione MAPK e programmi trascrizionali dipendenti da NFAT/NF-κB/AP-1, influenzando la formazione della sinapsi immunologica e il rimodellamento del citoscheletro. Una segnalazione ITK deregolata è stata associata ad alterazioni della polarizzazione Th2/Th17, a un’immunità antivirale compromessa e a stati aberranti di attivazione linfocitaria rilevanti per la biologia delle immunodeficienze e delle malattie linfoproliferative. In quanto nodo di via che collega il riconoscimento dell’antigene agli output trascrizionali, ITK è spesso studiato nelle reti di segnalazione immunitaria, nelle decisioni di lineage delle cellule T e nel crosstalk della segnalazione infiammatoria.

Emt Il plasmide Double Nickase (h) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus ITK nelle linee cellulari human. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di ITK. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di ITK. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con ITK interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.