eIF2C4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401658-ACT

AGO4, também conhecido como eIF2C4, codifica a Argonauta-4, um membro da família de proteínas Argonauta que se liga a pequenos RNAs para orientar a regulação da expressão gênica de maneira específica à sequência. Por meio de processos associados ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), a AGO4 contribui para mecanismos de controle pós-transcricional que moldam a estabilidade do mRNA e a tradução no citoplasma. A regulação de RNA dependente de Argonauta influencia vias que governam a identidade celular, a diferenciação e as respostas ao estresse, e redes alteradas de pequenos RNAs são frequentemente estudadas no contexto da sinalização oncogênica e da regulação imune. A desregulação do controle gênico mediado por Argonauta tem sido associada, em ambientes de pesquisa, a uma remodelação anômala do transcriptoma observada em múltiplos fenótipos celulares relevantes para doenças.

eIF2C4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AGO4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

eIF2C4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AGO4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AGO4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de eIF2C4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AGO4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de eIF2C4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via eIF2C4 em células tumorais com expressão de AGO4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.