Dyrk1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401928-ACT

DYRK1A codifica a quinase 1A regulada por fosforilação de tirosina de dupla especificidade (Dyrk1A), uma quinase de serina/treonina que modula programas de fosforilação de proteínas que governam a progressão do ciclo celular, a diferenciação neuronal e a função sináptica. A Dyrk1A integra-se a redes de sinalização que controlam a regulação transcricional, o splicing de RNA e a proteostase, com substratos descritos e ligações a vias que influenciam o estado da cromatina e respostas ao stress. Alterações na dosagem e na atividade de DYRK1A estão implicadas em fenótipos do neurodesenvolvimento, incluindo efeitos sensíveis à dosagem associados à síndrome de Down e a biologia relacionada ao espectro do autismo, e também foram estudadas em contextos de proliferação de células cancerígenas. Essas características tornam o DYRK1A um nó útil para dissecar circuitos regulatórios dirigidos por quinases em modelos celulares humanos.

Dyrk1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DYRK1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dyrk1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DYRK1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DYRK1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dyrk1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DYRK1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dyrk1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dyrk1A em células tumorais com expressão de DYRK1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.