Dnmt3b CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420036-ACT

Das murine Dnmt3b kodiert eine de-novo-DNA-Methyltransferase, die 5‑Methylcytosin an CpG-Dinukleotiden anlagert, um während der Embryonalentwicklung und der Linienfestlegung epigenetische Stilllegung zu etablieren und aufrechtzuerhalten. DNMT3B wirkt mit DNMT3A sowie der durch UHRF1/DNMT1 vermittelten Erhaltungsmethylierung zusammen, um Chromatinzustände, Transkriptionsprogramme und die genomische Stabilität zu formen – einschließlich der Repression transponierbarer Elemente und der Regulation des Imprintings. Dieses Enzym ist in Chromatin-Remodeling- und Histonmodifikationswege eingebunden und beeinflusst dadurch die Methylierungsdynamik von Promotoren und Enhancern über Differenzierung und Reprogrammierung hinweg. Eine veränderte DNMT3B-Aktivität ist mit aberranten Methylierungsmustern verbunden, wie sie bei Entwicklungsstörungen und der krebsassoziierten epigenetischen Dysregulation beobachtet werden, und macht DNMT3B zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung epigenomabhängiger Genregulation.

Dnmt3b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Dnmt3b-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dnmt3b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Dnmt3b-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Dnmt3b-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dnmt3b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Dnmt3b-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dnmt3b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dnmt3b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Dnmt3b-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.