Plásmido CRISPR de Activación (m) Dnmt3a: sc-420035-ACT

El gen Dnmt3a de ratón codifica una ADN metiltransferasa de novo que establece patrones de metilación de CpG durante el desarrollo y el compromiso del destino celular, moldeando la accesibilidad de la cromatina y programas transcripcionales de larga duración. DNMT3A coopera con DNMT3B y DNMT1 para mantener la memoria epigenética, vinculando la metilación del ADN con redes de modificación de histonas y la represión transcripcional. Su actividad influye en la diferenciación, la impronta genómica y el silenciamiento de transposones, y la desregulación de la metilación dependiente de DNMT3A se asocia con una especificación de linaje alterada e inestabilidad epigenética en modelos de enfermedad. Por ello, Dnmt3a se estudia ampliamente en vías que gobiernan la biología de las células madre, la regulación hematopoyética y el control de la expresión génica dependiente de la metilación.

Dnmt3a El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Dnmt3a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dnmt3a El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Dnmt3a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Dnmt3a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dnmt3a. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Dnmt3a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dnmt3a en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dnmt3a en células tumorales con expresión de Dnmt3a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.