DnaJB2 Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-409526

Descripción general

DNAJB2 codifica DnaJB2, un miembro de la familia de co-chaperonas Hsp40/DnaJ que se asocia con Hsp70 para reconocer proteínas mal plegadas y favorecer su replegamiento o su eliminación. DnaJB2 contribuye a la proteostasis neuronal coordinando la degradación asistida por chaperonas y el control de calidad vinculado al proteasoma, lo que ayuda a limitar la acumulación de especies proteicas ubiquitinadas. A través de estas funciones, DNAJB2 se relaciona con las respuestas celulares al estrés, las vías de homeostasis proteica y el mantenimiento de la integridad sináptica y axonal. La desregulación o las mutaciones en DNAJB2 se han asociado con fenotipos neurodegenerativos y trastornos relacionados con neuropatía periférica, por lo que es relevante para estudiar los mecanismos de estrés proteotóxico en células humanas.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO DnaJB2 (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen DNAJB2 en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus DNAJB2, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR DnaJB2 (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido DNAJB2.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido DnaJB2 CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto DNAJB2.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus DNAJB2 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones DNAJB2 críticos para la función DnaJB2
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.