Plasmide CRISPR d'Activation (h) DISC-1: sc-404052-ACT

Le gène humain DISC1 code DISC-1, une protéine d’échafaudage multifonctionnelle qui coordonne des complexes protéiques impliqués dans le neurodéveloppement, la croissance des neurites, le trafic intracellulaire et l’organisation synaptique. DISC-1 interagit avec des régulateurs du cytosquelette et des protéines du centrosome pour influencer la migration neuronale et la stratification corticale, et elle module des réseaux de signalisation impliqués dans la plasticité synaptique et les processus dépendants de l’AMPc. Les variations génétiques et la dérégulation des interactions protéiques associées à DISC1 ont été liées à une connectivité cérébrale altérée et à une susceptibilité accrue aux maladies neuropsychiatriques, faisant de DISC-1 un nœud clé pour les études mécanistiques des circuits neuronaux et des réponses cellulaires au stress.

DIsc-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DISC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DIsc-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DISC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DISC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DIsc-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DISC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DIsc-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DIsc-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DISC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.