DGK-κ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410308-ACT

DGKK codifica la diacilglicerolo chinasi kappa (DGK-κ), una chinasi lipidica che fosforila il diacilglicerolo generando acido fosfatidico, contribuendo così a modulare la dinamica della segnalazione dei secondi messaggeri. Controllando l’equilibrio tra gli effettori dipendenti da DAG e quelli dipendenti da PA, DGK-κ influenza gli output di segnalazione collegati a PKC e a Ras/MAPK, con effetti a valle sul traffico di membrana, il rimodellamento del citoscheletro e i programmi trascrizionali. L’attività di DGKK è stata associata a processi cellulari rilevanti per la fedeltà della trasduzione del segnale in contesti immunitari ed epiteliali, e l’alterazione della segnalazione della famiglia DGK è spesso studiata in relazione a proliferazione disregolata e segnalazione infiammatoria. DGKK è inoltre oggetto di studio per il suo contributo a perturbazioni delle reti di segnalazione lipidica associate a patologie, incluse vie collegate alla segnalazione oncogenica e alla regolazione immunitaria.

DGK-κ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DGKK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DGK-κ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DGKK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DGKK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DGK-κ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DGKK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DGK-κ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DGK-κ nelle cellule tumorali con espressione di DGKK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.