Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dapper1: sc-405361-ACT

Le gène humain DACT1 code Dapper1, une protéine d’échafaudage/adaptatrice cytoplasmique qui module la signalisation dépendante de Dishevelled et contribue à coordonner l’activité de la voie Wnt au cours du développement embryonnaire et du maintien de l’homéostasie tissulaire. Dapper1 a été impliquée dans la régulation de la polarité planaire cellulaire et de la transcription dépendante de la β-caténine, influençant des processus tels que la polarité cellulaire, la migration et la différenciation. Une expression altérée de DACT1 ou des changements de contexte des voies associées ont été liés à une dérégulation de la signalisation Wnt observée dans plusieurs cadres pathologiques, notamment des anomalies du développement et des phénotypes liés au cancer. Ces caractéristiques font de DACT1 un nœud pertinent pour disséquer la dynamique des réseaux Wnt et leurs interactions avec d’autres voies de morphogènes et du cytosquelette.

Dapper1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DACT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dapper1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DACT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DACT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dapper1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DACT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dapper1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dapper1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DACT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.