CLIP-170 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401279-ACT

Humanes **CLIP1** kodiert **CLIP-170**, ein zytoplasmatisches Plus-Ende-Tracking-Protein, das an die Enden von Mikrotubuli bindet und diese mit zellulären Cargo-Strukturen und kortikalen Orten verknüpft. CLIP-170 koordiniert die Mikrotubuli-Dynamik, das Einfangen der Kinetochoren sowie Interaktionen mit Dynein–Dynactin und anderen +TIP-Komplexen und unterstützt dadurch den intrazellulären Transport, die Organisation der Spindel und die Zellpolarität. Über diese Funktionen trägt CLIP1 zu Prozessen wie dem mitotischen Fortschreiten und gerichteter Migration bei; dabei werden eine veränderte Mikrotubuli-Regulation und gestörte Trafficking-Netzwerke häufig mit dem Verhalten von Tumorzellen und neuroentwicklungsbedingten Funktionsstörungen in Verbindung gebracht. CLIP-170 wird daher breit in Signalwegen untersucht, die Zytoskelett-Umbau, Chromosomensegregation und Organellenpositionierung steuern.

CLIP-170 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLIP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLIP-170 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLIP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLIP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLIP-170-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLIP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLIP-170-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLIP-170-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLIP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.