Plásmido CRISPR de Activación (h) claudin-6: sc-403405-ACT

CLDN6 codifica la claudina-6, una proteína tetraspan de las uniones estrechas (tight junctions) que contribuye a la formación de la barrera epitelial, la polaridad ápico-basal y la permeabilidad paracelular selectiva. Mediante su participación en complejos de uniones estrechas con otras claudinas y proteínas de andamiaje como TJP1/ZO-1, la claudina-6 ayuda a coordinar la adhesión célula–célula y la señalización asociada a las uniones, en conexión con programas de diferenciación y la morfogénesis epitelial. Se han descrito alteraciones en la expresión de CLDN6 en múltiples contextos de cáncer y en modelos de desarrollo, donde una integridad desregulada de las uniones estrechas puede influir en la invasión, fenotipos asociados a la metástasis y la plasticidad epitelial. Por ello, CLDN6 se estudia con frecuencia como marcador y regulador funcional de la remodelación de las uniones y de las transiciones de estado de linaje en sistemas epiteliales humanos.

claudin-6 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CLDN6 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

claudin-6 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CLDN6 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CLDN6, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de claudin-6. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CLDN6 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de claudin-6 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía claudin-6 en células tumorales con expresión de CLDN6 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.