CKR-8 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m): sc-419709

Übersicht

Ccr8 kodiert den Chemokinrezeptor CKR-8 (CCR8), einen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor, der ausgewählte CC‑Chemokine bindet und so die Chemotaxis von Leukozyten sowie deren Positionierung in entzündeten oder gewebsresidenten Nischen reguliert. Die CKR-8‑Signalübertragung aktiviert Gαi‑abhängige Signalwege, die cAMP, den Calciumfluss, die PI3K–AKT‑ und die MAPK‑Aktivität beeinflussen und damit Zytoskelett-Umbau und gerichtete Migration koordinieren. In der Mausimmunbiologie wird CCR8 häufig im Zusammenhang mit T‑Zell‑Polarisierung und -Trafficking untersucht, einschließlich regulatorischer und Typ‑2‑assoziierter Antworten, sowie mit der Rekrutierung myeloider Zellen. Fehlregulierte, an CCR8 gekoppelte Chemokin-Netzwerke sind für chronisch entzündliche Situationen und tumorassoziierte Immunmikroumgebungen relevant, in denen veränderte Zellmigration und -retention krankheitsassoziierte Phänotypen prägen können.

CKR-8 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des Ccr8-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Ccr8-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das CKR-8 HDR-Plasmid (m) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte Ccr8 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem CKR-8 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das Ccr8 offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des Ccr8-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf Ccr8 Exon(e) abzielt, die für die CKR-8 Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.