CD40 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400524-ACT

O CD40 humano codifica um receptor coestimulatório da superfamília dos receptores de TNF, expresso principalmente em células apresentadoras de antígeno, incluindo células B, células dendríticas e macrófagos, onde integra sinais de CD40L para moldar a imunidade adaptativa. A ligação do CD40 ativa a sinalização canônica e não canônica de NF-κB, vias de MAPK e programas dependentes de PI3K/AKT que regulam a apresentação de antígenos, a produção de citocinas, a sobrevivência e a proliferação de células B, bem como a recombinação de troca de classe. Por meio dessas vias, o CD40 influencia a dinâmica do centro germinativo e as respostas humorais dependentes de células T, e a atividade alterada do CD40 tem sido associada à desregulação imune e à patobiologia inflamatória. A sinalização desregulada de CD40 também é relevante para a imunologia tumoral e para a pesquisa em neoplasias de células B, devido ao seu papel em estados de ativação celular e na comunicação com o microambiente.

CD40 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CD40 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD40 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CD40 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CD40, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD40. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CD40 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD40 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD40 em células tumorais com expressão de CD40 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.