Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD3-ε: sc-400240-ACT

CD3E code pour CD3-ε, un composant essentiel du complexe récepteur des lymphocytes T (TCR)-CD3, qui couple la reconnaissance de l’antigène à la signalisation intracellulaire nécessaire au développement des thymocytes et à l’activation des lymphocytes T périphériques. Grâce aux motifs d’activation à base de tyrosine des immunorécepteurs (ITAM) présents dans les chaînes CD3, CD3-ε soutient les cascades de kinases proximales impliquant LCK et ZAP70 et propage des voies en aval telles que NF-κB, NFAT et MAPK afin de réguler la production de cytokines, la prolifération et la différenciation. Une perturbation de l’expression de CD3E ou de l’assemblage du complexe CD3 peut dérégler les seuils de signalisation du TCR, altérer l’homéostasie immunitaire et contribuer à des phénotypes de dysrégulation immunitaire. En tant que molécule définissant la lignée des cellules T, CD3-ε est largement utilisée dans les études sur l’architecture de la signalisation des récepteurs, les états fonctionnels des lymphocytes T et les modèles d’immuno-oncologie in vitro.

CD3-ε Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CD3E sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD3-ε Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CD3E dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CD3E, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD3-ε. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CD3E natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD3-ε au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD3-ε dans les cellules tumorales présentant une expression de CD3E silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.